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特性說明：

產(chǎn)品介紹：

H2DCFDA(DCFH-DA)是一種通用的氧化應(yīng)激指示劑。具細(xì)胞膜滲透性，本身無熒光。一旦進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞酯酶水解生成2'7'-二氧二氫熒光素(2'7'-Dichlorodihydrofluorescein, DCFH) ，之后被快速氧化生成強(qiáng)熒光產(chǎn)物2'7'-二氯熒光素 (2'7'-dichlorofluorescein, DCF) 。可用熒光光譜檢測(Ex/Em= 504/529nm)。適用于檢測活性氧(ROS)和一氧化氮(.NO) ，以及確定總的氧化應(yīng)激水平。普遍用來監(jiān)測細(xì)胞氧化還原過程。

本品以粉末形式提供， 可直接溶于無水DMSO配制成1-10mM儲存液，常用工作濃度1-10μM. 需根據(jù)自身的實驗體系或參考文獻(xiàn)進(jìn)行優(yōu)化。

使用方法(僅作參考)

以下步驟是來源于大量文獻(xiàn)總結(jié)的簡易操作流程，僅作參考。用戶需根據(jù)特定的應(yīng)用和敏感性來做調(diào)整。

1）將低溫保存的凍干粉取出回至室溫， 低速離心使粉末落到瓶底。之后加入適量無水DMSO或其他有機(jī)溶劑配制成1-10mM儲存液。未用完的DMSO儲存液需分裝并避光凍存在-20℃，避免反復(fù)凍融。

2）于正式實驗前，用生理鹽緩沖液(比如: PBS, HBSS, HEPES) 稀釋到工作濃度1-10μM。需根據(jù)具體應(yīng)用來調(diào)整合適的工作濃度。

3) 吸走培養(yǎng)液， 加入步驟2)配制的染色工作液到細(xì)胞內(nèi)，室溫或30°C孵育5~ 60min。

4) 吸走染色工作液，用預(yù)熱的生理緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)液清洗一遍。重新加入預(yù)熱的生理緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)液，在適宜溫度內(nèi)孵育。對于二乙酸酯衍生物，需要短暫復(fù)原時間讓細(xì)胞內(nèi)酯酶將其水解，從而讓染料對氧化應(yīng)激生反應(yīng)。最佳的復(fù)原時間范圍很廣,由于某些細(xì)胞類型通常顯示極其低水平的酯酶活性。

5) 將細(xì)胞暴露于實驗刺激物之前，先測定加載細(xì)胞的背景熒光強(qiáng)度。

6）根據(jù)以下情況評估陰性對照(Negative control)

6.1綠色發(fā)射光譜內(nèi)檢查未染色細(xì)胞的自熒光情況。

6.2對于流式分析，查明染料加載和處理后細(xì)胞的前向角散射和側(cè)向角散射是不變。細(xì)胞尺寸的變化可能與起泡或萎縮有關(guān)，由于處理或有毒反應(yīng)引起的。

6.3對包含和不包含刺激物的染料和緩沖液/培養(yǎng)基的無細(xì)胞混合物進(jìn)行熒光檢測。在不含細(xì)胞外酯醇和其他氧化酶的情況下，隨著時間熒光的逐漸增加可能與瞬間水解、空氣氧化、和/或光誘導(dǎo)氧化有關(guān)。

6.4檢查培養(yǎng)在生長培養(yǎng)液或簡單緩中液內(nèi)的未處理加載細(xì)胞(對照)的熒光。在健康細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)酶和/或天然抗氧化劑會清除這些氧自由基。經(jīng)過染料加載復(fù)原時間后，健康細(xì)胞應(yīng)該表現(xiàn)出低水平的熒光信號，且在整個實驗期間相對穩(wěn)定。然而，逐漸增加(由于自氧化)或降低(由于細(xì)胞內(nèi)染料喪失或光淬滅)也有可能觀察到。在不含任何刺激物或誘導(dǎo)劑的體系內(nèi)，健康和未處理細(xì)胞突然發(fā)現(xiàn)強(qiáng)熒光，表明細(xì)胞發(fā)生死亡或一些其他的氧化事件。

7）建立陽性對照(Positive control) ，可能用以下方法刺激氧化活性

7.1腫瘤促進(jìn)劑(PMA，工作濃度100pM~ 10μM)

7.2 H2O2或TBHP (終濃度~ 100μM) (根據(jù)細(xì)胞本身 對其的靈敏度和反應(yīng)性來提高或降低濃度)

8)確保剌激藥物或化合物不會引起染料熒光淬滅。檢查化合物的吸收光譜，確定化合物的吸收峰不會與氧化后染料的最大激發(fā)或發(fā)射光諾發(fā)生重疊。

注意事項：

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

本產(chǎn)品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應(yīng)用或其他用途。