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特性說明：

產品描述：

花菁類染料（Cyanine Dyes）是一種在兩個氮原子間含聚亞甲基橋鍵且攜帶一非定域電荷的分子。

歸其結構特征，花菁素具有極其高的消光系數通常高于 100,000L?mol ^-1 ?cm ^-1 。不同的替代基允許控制發光團的性能比如吸光波長，光穩定性和熒光強度。例如，通過選擇不同長度的聚亞甲基橋鍵能夠控制吸光和熒光波長：花菁素越長，吸光和發射波長更高，高達至近紅外區。

在生命科學領域廣受歡迎的花菁類染料由美國卡耐基梅隆大學（CMU）的 Alan Waggoner 教授和同事于二十世紀 90 年代早期研發應用。這些染料呈現出低的生物分子非特異性結合，并由其巨大的消光系數和良好的量子產量產生明亮的熒光。目前商業化可提供各種反應性衍生物，比如點擊化學用的 N-羥基琥珀酰亞胺酯，馬來酰亞胺，疊氮化物和其他衍生物。目前花菁染料常以兩種異構體的形式供應：一種非磺化的花菁類染料和磺化的花菁類染料，對于許多應用，兩種是可以互相替換的，因其光譜屬性基本相同。兩種染料都可用于 DNA 和蛋白質等生物分子的標記。兩者的區別在于溶解度：磺化染料具水溶性，可以在水環境中標記，無需有機共溶劑，且在水中不易聚集。

Sulfo-Cyanine3 NHS Ester (Sulfo-Cyanine3 SE)是 Cyanine3 的水溶性、胺反應活化酯，能夠在純水溶性環境或無任何有機溶劑反應體內進行蛋白和多肽的有效標記。非常適合具極低水溶性和易變性蛋白的標記。

使用方法

【注意】：Cy 染料和生物分子的比例（F/P）=4~12 之間熒光強度最高。F/P 過高，熒光探針會自我淬滅并且影響生物分子的活性。CyDye NHS 在 pH 8.5~9.4 內標記抗體 10min，F/P 可達 5~6。但在 pH 7.0 內幾乎無反應。我司內部使用 Cy3 NHS 標記 Anti-GST 抗體發現按 1:1，1:5，1:10，和 1:20 標記得到的 F/P 分別為 0.28:1，1.16:1，2.3:1 和 4.6:1。

一、 水溶性 Cy3 NHS 標記 Anti-GST 抗體【其它 CyDye NHS 參考此方法進行并做適當摸索】

商業化購買的抗體如果含有其他蛋白（如血清白蛋白，明膠等），或溶于帶氨基的緩沖液，會影響標記。需在標記前對抗體進行純化。

1. 于 1L 0.15M NaCl 溶液中透析 Anti-GST（0.5ml，3mg/ml），室溫或 4℃透析 4h。

2. 換用 1L 新鮮的 0.15M NaCl 溶液，4℃透析過夜。

3. 第二天再換用 1L 0.1M NaHCO ₃ （pH 8.3），4℃透析 4h。

4. 【可選】用 0.22μm 低吸附濾膜過濾透析后的抗體溶液。

5. 用 0.1M NaHCO ₃ （pH 8.3）稀釋少量的抗體，于 280nm 測其紫外吸收值并計算標記抗體的總量（IgG抗體摩爾吸光系數為 170,000 at 280nm）。

6. 用 DMSO 配制 Cy3 NHS（Mw:765.95），濃度為 10mg/ml。根據 CyDye NHS 和抗體的使用比值（比如1:20）來計算所需要染料的體積。然后慢慢將其加入到抗體溶液中，同時于暗處低速攪拌，室溫 45min。

7. 用 1L 0.15M NaCl 溶液，常溫或 4℃避光透析 4h，以除去未標記上的 Cy3 NHS。

8. 換用新鮮的 1L 0.15M NaCl 溶液，4℃避光透析過夜。

9. 換用 1L 0.01M PBS/0.01% NaN ₃ 溶液室溫或 4℃避光透析 4h，然后在 4℃避光再次透析過夜。

10. 【可選】用 0.22μm 低吸附濾膜過濾透析后的抗體溶液。

11. 用 0.01M PBS/0.01% NaN ₃ 溶液整數倍稀釋標記抗體，測定 280nm（蛋白）和 552nm（Cy3）處的紫外可見吸光度。

12. 產品冷凍干燥成粉末或置于 0.01M PBS/0.01% NaN ₃ 溶液中，-20℃避光保存。

【F/P 計算】：

Cy3 在 552nm 下的摩爾吸光系數為 150,000 L?mol ^-1 ?cm ^-1 ，此蛋白在 280nm 的摩爾吸光系數為 170,000L?mol ^-1 ?cm ^-1 ，不同蛋白的摩爾吸光系數不同。Cy3 本身在 280nm 處的吸收是 552nm 處的 8%。按照以下公式計算 F/P 值。

[Cy3] = A ₅₅₂ /150000; [Antibody] = [A ₂₈₀ -(0.08×A ₅₅₂ )]/170000

F/P final = [Cy3]/ [Antibody]= [1.13×A ₅₅₂ ]/ [A ₂₈₀ -(0.08×A ₅₅₂ )]

二、 水溶性 Cy5 NHS 記 標記 （D-ser ² ） ）- Leu-Enkephalin 【其它 CyDye NHS 參考此方法進行并做適當摸索】

1. 低溫保存的 Cy5 NHS 置于室溫回溫至少 20min。往 1mg 粉末內加入 400μl 高品質無水 DMSO 充分溶解。同樣，低溫保存的玻璃瓶裝的（D-ser ² ）- Leu-Enkephalin（YSGFLT，0.75mg）室溫回溫后加入 400μl高品質無水 DMSO 充分溶解。將 400μl Cy5 NHS 加入 400μl 多肽內。【染料與多肽通常質量比 1:1】。

2. 再加入 15μl 三乙胺，常溫避光攪拌反應混合物，過夜。【若多肽穩定性較弱，則于 4℃反應過夜】。

3. 用 HPLC 純度多肽。使用 C18 柱子（25cm×10mm），每次上樣注入 2×400μl，30min 梯度洗脫從 0.1%TFA 水溶液到 MeCN:H ₂ O (0.1% TFA)=70：30，流速 4ml/min。（對不同的多肽選擇不同的合適 HPLC梯度流動相）

4. 收集適當的色帶峰，標記多肽的保留時間比未標記的多肽長。

5. 產品冷凍干燥成粉末或置于水溶液中，-20℃避光保存。必要時可用質譜表征。

6. CyDye 標記的蛋白/多肽穩定性取決于蛋白本身。例如標記的 IgG 在 4℃可避光保存 2 月，更長保存需加入等體積甘油-20℃避光保存。

【F/P 計算】：

Cy5 在 650nm 下的摩爾吸光系數為 250,000L?mol ^-1 ?cm ^-1 ，此蛋白在 280nm 的摩爾吸光系數為 170,000L?mol ^-1 ?cm ^-1 ，不同蛋白的摩爾吸光系數不同。Cy5本身在 280nm 處的吸收是 650nm 處的 5%。按照以下公式計算 F/P 值。

[Cy5] = A ₆₅₀ /250000; [Peptide] = [A ₂₈₀ -(0.05×A ₆₅₀ )]/170000

F/P final = [Cy5]/ [Peptide]= [0.68×A ₆₅₀ ]/ [A ₂₈₀ -(0.05×A ₆₅₀ )]

注意事項：

1）Sulfo-Cyanine3 NHS Ester 水溶液的穩定性很弱，建議現配現用。Sulfo-Cyanine3 NHS Ester DMSO 溶液的穩定性相對高，建議置于-20℃避光保存，2 周穩定。

2） Sulfo-Cyanine3 NHS Ester 具水溶性，除非標記實驗嚴格要求純水溶性環境，建議用 DMSO 溶解配制成母液后使用。一般情況下，Cy 系列染料在含有機溶劑體系內的標記效率相對高些。

3） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

本產品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應用或其他用途。