DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（膠體金試紙條型）使用說明書

【產(chǎn)品名稱】

DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（膠體金試紙條型）

【原理概述】

本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)：在常溫恒溫條件下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復(fù)合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結(jié)合蛋白SSB的幫助下，侵入雙鏈DNA模板，在侵入位點(diǎn)形成D-loop區(qū)域，并開始對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行掃描；待找到與引物互補(bǔ)的目的區(qū)域后，復(fù)合體Rec/ssDNA解體的同時(shí)，聚合酶也結(jié)合到引物的3’末端，開始鏈的延伸。依賴nfo酶的作用，加入根據(jù)模版設(shè)計(jì)的特異的分子探針，使用膠體金技術(shù)（三明治夾心法）可以對(duì)最終結(jié)果進(jìn)行檢測。

【產(chǎn)品特點(diǎn)】

本試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短（僅需12 mins）等優(yōu)點(diǎn)，反應(yīng)組分為干粉狀態(tài)，操作簡便，易于保存。

本試劑對(duì)設(shè)備要求低，金屬浴、水浴鍋等即可進(jìn)行反應(yīng)操作，無需購買PCR擴(kuò)增儀等價(jià)格高昂的專屬設(shè)備。

【引物設(shè)計(jì)】

建議使用長度在 30-35 bp的引物，引物過短會(huì)影響擴(kuò)增速度和檢測靈敏度；下游引物的5’端標(biāo)記一個(gè)修飾基團(tuán)（常用生物素）。引物設(shè)計(jì)避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)而影響擴(kuò)增；擴(kuò)增子長度建議在150-300 bp，通常不超過500 bp。

【熒光探針設(shè)計(jì)】

在上下游引物中間，設(shè)計(jì)一段長度為46-52nt與目的片段互補(bǔ)的序列；5’端修飾一個(gè)抗原標(biāo)記（根據(jù)使用試紙條選擇，典型為FAM）; 在5’端和3’末端的中部位置標(biāo)記一個(gè)dSpacer（四氫呋喃，THF），作為nfo的識(shí)別位點(diǎn)；3’末端標(biāo)記一個(gè)修飾基團(tuán)，例如胺基、磷酸基團(tuán)或C3-Spacer等。

【試劑盒組成】

【試劑盒儲(chǔ)存】

【操作步驟】

1.提前30分鐘將試劑盒所需組分取出，室溫融化，震蕩混勻。

2.每個(gè)干粉反應(yīng)管加入10 μL A buffer（注意：A buffer需完全融化混勻，否則會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)效果產(chǎn)生影響）；

3.每個(gè)反應(yīng)管分別加入1 μL上游引物、1 μL下游引物和0.4 μL探針（引物和探針濃度為10 μM，對(duì)于多個(gè)反應(yīng)、步驟2和步驟3可以混合后再分裝至反應(yīng)管中）；

4.向反應(yīng)管中依次加入3.6 μL ddH2O和2 μL核酸模板（可根據(jù)核酸濃度調(diào)整加入的核酸模板體積，并相應(yīng)調(diào)整加入的ddH2O體積，至模板與ddH2O總體積為5.6 μL）；

5.最后向反應(yīng)管中加入2 μL B buffer并充分混合（對(duì)于多個(gè)反應(yīng)，建議將B buffer加至反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè)，上下顛倒反應(yīng)管8-10次混勻）；

6.混勻后，將反應(yīng)液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應(yīng)管放入恒溫設(shè)備中37-39 oC孵育8-12 mins；

7. 反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL加入含有190 μL ddH2O的離心管中，混合均勻后，將膠體金試紙條的樣品端插入離心管中平衡，5 mins內(nèi)觀察質(zhì)控線與檢測線判讀結(jié)果。

體系配制

【注意事項(xiàng)】

1. 由于試劑盒靈敏度非常高，在進(jìn)行反應(yīng)時(shí)請(qǐng)注意避免微量核酸污染，并盡量考慮設(shè)置空白對(duì)照以確認(rèn)是否有核酸污染。

2. 試劑盒保質(zhì)期12個(gè)月。每次使用時(shí)，請(qǐng)取出實(shí)驗(yàn)所需的MIRA反應(yīng)單元的數(shù)量，置于冰浴條件下并在8小時(shí)內(nèi)使用；剩余部分，請(qǐng)置于存儲(chǔ)條件下。

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