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活花菁類染料（Cyanine Dyes）是一種在兩個氮原子間含聚亞甲基橋鍵且攜帶一非定域電荷的分子【見下圖】。

歸其結構特征，花菁素具有極其高的消光系數通常高于100,000 L?mol-1?cm-1。不同的替代基允許控制發光團的性能比如吸光波長，光穩定性和熒光強度。例如，通過選擇不同長度的聚亞甲基橋鍵能夠控制吸光和熒光波長：花菁素越長，吸光和發射波長更高，高達至近紅外區。

在生命科學領域廣受歡迎的花菁類染料由美國卡耐基梅隆大學（CMU）的Alan Waggoner教授和同事于二十世紀90年代早期研發應用。這些染料呈現出低的生物分子非特異性結合，并由其巨大的消光系數和良好的量子產量產生明亮的熒光。目前商業化可提供各種反應性衍生物，比如點擊化學用的N-羥基琥珀酰亞胺酯，馬來酰亞胺，疊氮化物和其他衍生物。目前花菁染料常以兩種異構體的形式供應：一種非磺化的花菁類染料和磺化的花菁類染料，對于許多應用，兩種是可以互相替換的，因其光譜屬性基本相同。兩種染料都可用于DNA和蛋白質等生物分子的標記。兩者的區別在于溶解度：磺化染料具水溶性，可以在水環境中標記，無需有機共溶劑，且在水中不易聚集。 

Sulfo-Cyanine5.5是一種水溶性，遠紅外發射的熒光團。因含4個磺基，該染料在中性pH中帶負電荷，且有非常高的親水性。

Sulfo-Cyanine5.5 NHS Ester (Sulfo-Cyanine5.5 SE)是Sulfo-Cyanine5.5的氨基反應活化酯。特別適合用于要求純水溶性環境或無任何有機溶劑反應體內的抗體、敏感蛋白和其他物質的熒光標記。標記后的分子適用于小動物活體成像研究。

使用方法：

儲【注意】：Cy染料和生物分子的比例（F/P）=4~12之間熒光強度最高。F/P過高，熒光探針會自我淬滅并且影響生物分子的活性。CyDye NHS在pH 8.5~9.4內標記抗體10min，F/P可達5~6。但在pH 7.0內幾乎無反應。我司（懋康生物）內部使用Cy3 NHS標記Anti-GST抗體發現按1:1，1:5，1:10，和1:20標記得到的F/P分別為0.28:1，1.16:1，2.3:1和4.6:1。

一、 水溶性Cy3 NHS標記Anti-GST抗體【其它CyDye NHS參考此方法進行并做適當摸索】

商業化購買的抗體如果含有其他蛋白（如血清白蛋白，明膠等），或溶于帶氨基的緩沖液，會影響標記。需在標記前對抗體進行純化。

1. 于1L 0.15M NaCl溶液中透析Anti-GST（0.5ml，3mg/ml），室溫或4℃透析4h。

2. 換用1L 新鮮的0.15M NaCl溶液，4℃透析過夜。

3.  第二天再換用1L 0.1M NaHCO3（pH 8.3），4℃透析4h。

4.    【可選】用0.22μm低吸附濾膜過濾透析后的抗體溶液。

5.  用0.1M NaHCO3（pH 8.3）稀釋少量的抗體，于280nm測其紫外吸收值并計算標記抗體的總量（IgG抗體摩爾吸光系數為170,000 at 280nm）。

6.  用DMSO配制Cy3 NHS（Mw:765.95），濃度為10mg/ml。根據CyDye NHS和抗體的使用比值（比如1:20）來計算所需要染料的體積。然后慢慢將其加入到抗體溶液中，同時于暗處低速攪拌，室溫45min。

7.  用1L 0.15M NaCl溶液，常溫或4℃避光透析4h，以除去未標記上的Cy3 NHS。

8.  換用新鮮的1L 0.15M NaCl溶液，4℃避光透析過夜。

9.  換用1L 0.01M PBS/0.01% NaN3溶液室溫或4℃避光透析4h，然后在4℃避光再次透析過夜。

10. 【可選】用0.22μm低吸附濾膜過濾透析后的抗體溶液。

11. 用0.01M PBS/0.01% NaN3溶液整數倍稀釋標記抗體，測定280nm（蛋白）和552nm（Cy3）處的紫外可見吸光度。

12.  產品冷凍干燥成粉末或置于0.01M PBS/0.01% NaN3溶液中，-20℃避光保存。

【F/P計算】：

Cy3在552nm下的摩爾吸光系數為150,000 L?mol-1?cm-1，此蛋白在280nm的摩爾吸光系數為170,000 L?mol-1?cm-1，不同蛋白的摩爾吸光系數不同。Cy3本身在280nm處的吸收是552nm處的8%。按照以下公式計算F/P值。

[Cy3] = A552/150000; [Antibody] = [A280-(0.08×A552)]/170000

F/Pfinal= [Cy3]/ [Antibody]= [1.13×A552]/ [A280-(0.08×A552)]

二、 水溶性Cy5 NHS標記（D-ser2）-Leu-Enkephalin【其它CyDye NHS參考此方法進行并做適當摸索】

1.  低溫保存的Cy5 NHS置于室溫回溫至少20min。往1mg粉末內加入400μl 高品質無水DMSO充分溶解。同樣，低溫保存的玻璃瓶裝的（D-ser2）-Leu-Enkephalin（YSGFLT，0.75mg）室溫回溫后加入400μl 高品質無水DMSO充分溶解。將400μl Cy5 NHS加入400μl 多肽內。【染料與多肽通常質量比1:1】。

2.  再加入15μl 三乙胺，常溫避光攪拌反應混合物，過夜。【若多肽穩定性較弱，則于4℃反應過夜】。

3.  用HPLC純度多肽。使用C18柱子（25cm×10mm），每次上樣注入2×400μl，30min梯度洗脫從0.1% TFA水溶液到MeCN:H2O (0.1% TFA)=70：30，流速4ml/min。（對不同的多肽選擇不同的合適HPLC梯度流動相）

4.  收集適當的色帶峰，標記多肽的保留時間比未標記的多肽長。

5.  產品冷凍干燥成粉末或置于水溶液中，-20℃避光保存。必要時可用質譜表征。

6.  CyDye標記的蛋白/多肽穩定性取決于蛋白本身。例如標記的IgG在4℃可避光保存2月，更長保存需加入等體積甘油-20℃避光保存。

【F/P計算】：

Cy5在650nm下的摩爾吸光系數為250,000 L?mol-1?cm-1，此蛋白在280nm的摩爾吸光系數為170,000 L?mol-1?cm-1，不同蛋白的摩爾吸光系數不同。Cy5本身在280nm處的吸收是650nm處的5%。按照以下公式計算F/P值。

[Cy5] = A650/250000; [Peptide] = [A280-(0.05×A650)]/170000

F/Pfinal= [Cy5]/ [Peptide]= [0.68×A650]/ [A280-(0.05×A650)] 

注意事項：

1.Sulfo-Cyanine5.5 NHS Ester水溶液的穩定性很弱，建議現配現用。Sulfo-Cyanine5.5 NHS Ester DMSO溶液的穩定性相對高，建議置于-20℃避光保存，1個月內穩定。

2.Sulfo-Cyanine5.5 NHS Ester具水溶性，除非標記實驗嚴格要求純水溶性環境，建議用DMSO溶解配制成母液后使用。一般情況下，Cy系列染料在含有機溶劑體系內的標記效率相對高些。

3.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

本產品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應用或其他用途。